Após se formar no ensino médio e enquanto estudava na WPA Federal Theatre Project, Stan Lee se tornou assistente na editora Timely Comics, a nova divisão de Martin Goodman voltada para revistas pulp e quadrinhos, com a ajuda do tio Robbie Solomon em 1939. Pouco tempo depois, ele foi contratado formalmente pelo editor da Timely, Joe Simon.

O primeiro trabalho que publicou foi "Captain America Foils the Traitor's Revenge", um conto ilustrado por Jack Kirby e lançado na edição nº3 da Captain America Comics, em maio de 1941. Essa história inicial introduziu a marca registrada do Capitão: o escudo que serve como arma de arremesso. Três meses depois, em agosto do mesmo ano, foi publicada a primeira cocriação de Lee, o Destroyer, em Mystic Comics #6. Durante esse mesmo período, ele ainda criou os personagens Jack Frost e Father Time.

No final do ano de 1941, Stan Lee - então com 19 anos - foi nomeado editor interino da Timely Comics após as saídas de Joe Simon e Jack Kirby da companhia. Lá, ele permaneceu como editor chefe da seção de quadrinhos e editor de arte até 1972, quando se tornou publisher no lugar de Martin Goodman.

No final da década de 1950, o grande sucesso da DC Comics com a criação da Liga da Justiça exigiu que a Timely - que já havia mudado o nome para Atlas Comics - corresse atrás do “prejuízo”. O publisher Martin Goodman então deu a Stan Lee a missão de criar um time de super-heróis totalmente novo. Lee se sentia velho demais para esse tipo de trabalho e pensava em abandonar a carreira, mas foi convencido pela esposa Joan a idealizar os próprios personagens do zero, no início dos anos 1960.

A primeira criação conjunta de Jack Kirby e Stan Lee foi o grupo de super-heróis chamado O Quarteto Fantástico, lançado nos quadrinhos em 1961. O aumento das vendas e da popularidade da editora, que já atendia pelo nome de Marvel Comics, motivou a produção de outros personagens e títulos. Foi assim que Lee criou o Incrível Hulk, o Homem de Ferro, Thor, os X-Men e Os Vingadores com Kirby, Doutor Estranho e Homem-Aranha com Steve Ditko e Demolidor com Bill Everett.

Durante toda a década de 1960, Lee editou a maior parte das séries de quadrinhos da editora, além de escrever uma coluna mensal conhecida como "Stan's Soapbox". Ele se tornou o rosto da Marvel Comics, e em 1981 se mudou para a Califórnia com o objetivo de participar do desenvolvimento das produções audiovisuais da editora.

As aparições de Stan Lee nos filmes de super-heróis baseados nos quadrinhos Marvel começaram em 1989, quando ele participou de O Julgamento do Incrível Hulk (1989). Mas foi a partir dos anos 2000, com a expansão do Universo Cinematográfico Marvel, que a presença especial de Lee nas telonas ficou mais recorrente.

Em 2008, ele foi premiado com a American National Medal of the Arts por sua contribuição na produção de quadrinhos. Três anos depois, em 2011, Lee ganhou uma estrela na calçada da fama, em Los Angeles, Califórnia.