Alessandra Negrini começou a estudar teatro aos 18 anos de idade, em 1988. A primeira oportunidade de trabalho na TV surgiu cinco anos depois, na Rede Globo, onde ganhou um papel secundário na novela Olho no Olho (1993). Por conta de seu bom desempenho em sua estreia, Negrini foi chamada para integrar o elenco da novela Cara e Coroa (1994). Entretanto seu primeiro papel marcante foi com a personagem-título da provocante minissérie Engraçadinha: Seus Amores e Seus Pecados, inspirada no romance de Nelson Rodrigues.

A partir daí, Negrini construiu uma bem sucedida carreira na televisão, onde participou de mais de 20 produções, entre novelas, séries e minisséries. Curiosamente, dois de seus papéis de maior destaque nos anos 2000 foram vilãs: a invejosa Selma de Desejos de Mulher (2002) e a mau-caráter Taís em Paraíso Tropical (2007), novela de Gilberto Braga onde a atriz interpretou duas irmãs gêmeas: a vilã já citada e a mocinha Paula. 

Negrini também se destacou na sétima arte. Sua estreia nos cinemas foi no drama O Que É Isso, Companheiro? (1997). Em 2007 ganhou o papel principal de Cleópatra (2007), interpretando uma das rainhas femininas mais icônicas de todos os tempos. Seu trabalho nesse drama biográfico dirigido por Júlio Bressane lhe rendeu o prêmio de Melhor Atriz no Festival de Brasília.