Nascida no Brooklyn, Lainie Levin é descendente de judeus asquenazes e judeus sefarditas e se formou na Universidade Hofstra em Hempstead, Nova York, em 1960. Durante a graduação Lainie começou a se aproximar da atuação ao participar de musicais escritos e dirigidos por Francis Ford Coppola e em 1961 fez sua na Broadway com The Happiest Girl in the World.

Um tempo depois ela teve algumas oportunidades de trabalhos na televisão como o sitcom The Nanny (1993) e St. Elsewhere (1982) e em 1982 a atriz integrou o elenco de My Favorite Year, obra que lhe rendeu uma indicação ao Globo de Ouro. No entanto, ela ficou mais conhecida quando foi escalada para interpretar Maria Portokalos em Meu Casamento Grego (2002), assim como na sequência lançada em 2016 e no terceiro filme de 2023. Com o sucesso da franquia, a atriz também participou do sitcom My Big Fat Greek Life inspirado no longa-metragem.

Ainda no cinema ela também participou de obras como Bratz - O Filme (2007), You Don't Mess with the Zohan (2008), Pixels (2015) e Tango Shalom (2021). Como membro da The Actors Studio, Lainie retornou à Broadway para refazer seu papel na adaptação teatral de My Favorite Year, recebendo uma indicação ao Tony Award por seu trabalho.